takya.ru страница 1
скачать файл


Влияние СКЭНАР-воздействия на интенсивность свободно-радикальных процессов и состояние про- и антиоксидантных систем плазмы крови и эритроцитов крыс при моделировании острой гипоксии

Е.М. Вечканов, И.А. Сорокина, А.И. Лукаш, А.А. Булгакова, И.М. Парибек, И.А. Алилуев

кафедра биохимии и микробиологии ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет»

344006 Ростов-на-Дону, ул. Б. Садовая, 105/42, факс: (863)263-8289, lukashai@rambler.ru

Резюме. В статье показаны некоторые особенности обменных процессов, интенсивность протекания свободно-радикальных реакций и состояние про- и антиоксидантной системы плазмы крови и эритроцитов крыс в остром периоде гипоксического синдрома. Отмечено, что электроимпульсное воздействие СКЭНАРом способствует снижению тяжести гипоксического состояния и ингибированию свободнорадикального окисления у экспериментальных животных.

Ключевые слова: СКЭНАР-воздействие, острая гипобарическая гипоксия, свободно-радикальные процессы (СРП), перекисное окисление липидов (ПОЛ), прооксидантная и антиоксидантная системы.

Актуальность. В связи с расширяющимся применением СКЭНАР-терапии актуальным представляется изучение биохимических последствий СКЭНАР-воздействия на интактный организм. Многие патологические состояния включают гипоксию разной этиологии. Частота гипоксических состояний определяет актуальность поиска средств и методов повышения резистентности организма к гипоксии эндо- и экзогенного происхождения. Особенно перспективны в этом отношении неинвазивные и немедикаментозные методы [7, 12, 23, 27]. К числу последних относится электроимпульсная терапия высокоамплитудными коротковолновыми низкочастотными электрическими сигналами (СКЭНАР-терапия) [2, 3, 5, 15, 22]. Положительный и саногенетический и антирадикальный эффект получен при лечении заболеваний периферической нервной системы [1], неврозов [4, 8], варикозном расширении вен, дерматитах [13, 17], бронхиальной астме и хроническом бронхите [20], ишемической болезни сердца [11].

Цель исследования. Изучение механизмов свободно-радикальной продукции и состояния системы про- и антиоксидантной защиты у лабораторных животных (крыс) при СКЭНАР-воздействии, в ходе моделирования гипоксического состояния путём контролируемой гипобарии.

Материалы и методы.

Лабораторные животные. Эксперименты проводили на белых крысах самках Rattus norvegicus массой 180-200 г в возрасте 9 месяцев. Животные содержались в пластиковых клетках при стандартном режиме освещения и температуры, имели доступ к стандартному лабораторному корму ad libitum.

Дизайн эксперимента. Все подопытные животные были разделены на 4 группы: 1 группа (n = 10) – контроль – интактные животные; 2 группа (n = 10) – крысы, подвергнутые действию гипобарической гипоксии; 3 группа (n = 10) – крысы, которым в течение 5 проводили сеанс СКЭНАР-воздействия; 4 группа (n = 10) – животные, прошедшие предадаптацию с помощью СКЭНАР-обработки в течение 5 дней и подвергнутые сеансу гипобарической гипоксии.

Моделирование гипоксии. Осуществляли в режиме 230 мм. рт. ст. (9000 м над уровнем моря) в течение 180 минут. Подопытные животные помещались в барокамеру объемом 20 л, снабженную щелочным поглотителем углекислоты. Декомпрессию и компрессию проводили в течение 15 мин. Изопрессия составляла 150 минут.

Методика проведения СКЭНАР-воздействия. Животные 3 и 4 группы получали сеансы СКЭНАР-воздействия с помощью аппарата «СКЭНАР-1 НТ» (ОКБ «Ритм», г. Таганрог) контактной стабильной методикой на эпилированную кожу в области позвоночника в режиме Var, интенсивностью 10 Fm продолжительностью 5 мин один раз в сутки в течение 5 суток в одно и то же время в утренние часы.

Извлечение биологического материала. У экспериментальных животных кровь получали путём декапитации по завершению последнего сеанса СКЭНАР-воздействия у 3-ей группы животных и непосредственно после сеанса гипобарии у 4-ой группы животных. Кровь собирали самотёком в стеклянные центрифужные пробирки с добавлением раствора гепарина из расчёта 25 ЕД/мл и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин для получения плазмы и эритроцитов. Печень крыс промывали в ледяном физиологическом растворе и гомогенизировали в смеси, содержащей 150 мМ сахарозы, 100 мМ Tris/HCl буфера рН 8,0 и 10 мМ DTT. Гомогенат центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин, полученный супернатант использовали для определения активности ксантиноксидазы.

Определение биохимических показателей. Определение уровней глюкозы, молочной кислоты и мочевой кислоты в плазме крови осуществляли с помощью коммерческих наборов реагентов: «Глюкоза GOD-PAP» НПФ «АБРИС+», «Молочная кислота» НПФ «АБРИС+», «Мочевая кислота UR-PAP» НПФ «АБРИС+» [9]. Концентрацию пировиноградной кислоты (ПВК) определяли модифицированным методом Умбрайта (1949) [9]. Количественное определение ксантина проводили микрометодом Williams (1950) в цельной крови в модификации Погореловой и соавт. (1983) [18]. Содержание диеновых конъюгатов (ДК) определяли в хлороформном экстракте по поглощению УФ света при длине волны 233 нм по Стальной (1977) [21]. Концентрацию шиффовых оснований определяли в хлороформном экстракте флуориметрическим методом при длине возбуждения 360 нм и длине эмиссии 440 нм по Bidlack (1973) [24]. Хлороформный экстракт готовили по методу Bligh и Dyer (1959) [25]. Уровень малонового диальдегида (МДА) оценивали по реакции с тиобарбитуровой кислотой по Стальной и Гаришвили (1977) [21]. Активность супероксиддисмутазы СОД оценивали по ингибированию восстановления нитросинего теразолия (НТС) супероксидом, генерируемым при аутоокислении адреналина по Сироте (1999) [19]. Активность каталазы определяли по реакции перекиси водорода с молибдатом аммония по Королюк (1988) [10]. Определение активности ксантиноксидазы (КО) проводиди спектрофотометрически в гомогенатах печени крыс по методу W. Kaminski и M. Jezewska (1979) [26]. Суммарную пероксидазную активность СПА оценивали по модифицированному бензидиновому методу [14]. Концентрацию белка в плазме крови определяли методом Лоури (1951) [28]. Содержание липидов в хлороформном экстракте определяли по реакции с фосфорнованилиновым реактивом с помощью коммерческого набора производства «Lachema» (Чехия).

Приборная база и статистическая обработка. Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре DU 800, «Beckman Coulter» (США), спектрофлуориметрические исследования проводили на спектрофлуориметре RF-5301 C «Shimadzu» (Япония), анализ некоторых биохимических показателей осуществляли на автоматическом биохимическом анализаторе «Сапфир 400» (Hirose Electronic Systems, Япония). Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента и пакета программ “Statistica 6.0”.

Результаты исследования и их обсуждение.

По завершению сеанса гипобарической гипоксии концентрация глюкозы в крови крыс 2-ой группы снизилась на 24%, тогда как содержание пирувата и лактата выросло в 2,6 и 3,4 раза от соответствующих значений контроля (см. рис. 1). Отношение лактат/пируват выросло на 50%. Полученные результаты свидетельствуют о развитии метаболических нарушений, связанных с быстрым истощением свободного пула глюкозы в плазме крови. Значительное увеличение содержание лактата на фоне отставания роста концентрации пирувата, а также возросшее отношение лактат/пируват свидетельствует о резком усилении процессов анаэробного гликолиза, на фоне  общего замедления окислительных процессов и затруднении энергозависимых процессов ресинтеза гликогена из молочной кислоты.





Рис. 1 Изменение некоторых показателей углеводного обмена (глюкозы, лактата, пирувата, соотношения лактат/пируват) и системы пуринового обмена (ксантина, мочевой кислоты и активности ксантиноксидазы) в плазме крови крыс при оксидативном стрессе, вызванном острой гипоксией и СКЭНАР-воздействии (в % по отношению к контролю).



Рис. 2 Изменение содержания продуктов ПОЛ (диеновых конъюгат, шиффовых оснований, малонового диальдегида) в эритроцитах крыс и плазме крови, а также активности СПА, СОД и каталазы в плазме крови крыс при оксидативном стрессе, вызванном острой гипоксией и СКЭНАР-воздействии (в % по отношению к контролю).
Животные, предадаптированные к действию гипобарической гипоксии путём проведения сеансов СКЭНАР-воздействия в течение 5 дней, показали более мягкое течение гипоксии. Концентрация глюкозы в плазме крови животных 4-ой группы статистически достоверно не изменилось по сравнению с контрольной величиной.

У предадаптированных СКЭНАР-воздействием животных по сравнению с крысами 2-ой группы содержание ПВК в плазме крови выросло на 16%, тогда как уровень лактата снизился в 1,5 раза, отношение лактат/пируват на 23%, что свидетельствует о наличии процесса катаболизма углеводовов, вызванного СКЭНАР-воздействием. Результаты исследования содержания лактата и пирувата дают основания предположить, что эффект СКЭНАР-воздействия связан с уменьшением глубины острой гипоксии, возможно сопряжённой с восстановлением уровня РО2.

Уровень ксантина и мочевой кислоты в плазме крови животных, подвергнутых гипоксии увеличился в 4,2 и 1,7 раза в соответствии с физиологической нормой (см. рис. 1). Очевидно гипоксическое повреждение тканей индуцирует разрушение нуклеиновых кислот, что сопровождается образованием пуриновых оснований, с последующей их модификацией и ксантин. Эти процессы носят ярко выраженный характер, а высокие значения ксантина в плазме крови свидетельствуют о развитии острой гипоксии, как на уровне клеток, так и всего организма. Накопление ксантина, в свою очередь, индуцирует работу прооксидантного фермента ксантиоксидазы (КО). Активности КО в группе животных, подвергнутых гипоксии, достоверно увеличилась на 33%. Развитие гипоксического синдрома способствует переходу ксантиноксидоредуктазной системы из ксантиндегидрогеназной формы активности в ксантиноксидазную, а усиление сдвига равновесия НАДН/НАД+ дополнительно усиливает процессы ПОЛ. Содержание ксантина и мочевой кислоты в плазме крови крыс, прошедших предадаптацию СКЭНАР-воздействием к действию гипобарической гипоксии снизилось на 29% и 10% в соответствии к величинам животных,подвергнутых гпоксии без предварительных процедур. В дополнение к полученным результатам, падение ферментативной активности КО на 16% отражает наличие положительной динамики СКЭНАР-воздействия на стабилизацию процессов системы пуринового обмена.

Действие гипоксии, соответствующей высоте 9000 м над уровнем моря в течение 3 часов, сопровождалось активизацией ПОЛ, что находит отражение в достоверном накоплении первичных (ДК), вторичных (МДА) и конечных (ШО) продуктов окисления липидов в плазме крови и мембранах эритроцитов. Содержание как начальных, так и конечных продуктов окисления липидов в мембранах эритроцитов крови крыс, подвергнутых гипоксии увеличилось на 42 и 59% от соответствующих значений контроля (см. рис. 2). Развитие гипоксического синдрома у животных 2-й группы нашло своё выражение в приросте МДА в эритроцитах и плазме крови крыс на 35% и 16% соответственно.

СКЭНАР-воздействие на интактных животных характеризовалось достоверным снижением содержания некоторых продуктов ПОЛ относительно контрольных величин (см. рис. 2). Если концентрация первичных продуктов пероксидации достоверно не изменилась, то уровень ШО и МДА в эритроцитах крови животных 3-ей группы снизился на 39% и 11% соответственно. Применение к животным СКЭНАР-воздействия перед сеансом гипоксии оказывало корригирующее влияние на процессы ПОЛ. По сравнению с показателями животных, подвергнутых гипоксии без предварительных процедур, содержание ДК, ШО и МДА в эритроцитах статистически достоверно меньше на 20%, 8% и 11% соответственно.

Важнейшим следствием усиления ПОЛ и изменения структурных свойств эритроцитарных мембран является их дестабилизация и нарушение барьерных функций [6, 16]. Для оценки функционального состояния мембран форменных элемен­тов крови после воздействия гипоксией нами были определены в плазме крови суммарная пероксидазная активность (СПА). У крыс, подвергнутых гипоксическому оксидативному стрессу по сравнению с контрольной группой, уровень СПА достоверно возрос на 72%.

Проведение предадаптации крыс путём СКЭНАР-воздействия не выявило существенной динамики в изменении структурных мембран эритроцитов и не показало достоверных изменений в 4 группе подопытных животных относительно крыс 2 группы.

Усиление свободнорадикального окисления в крови у крыс при гипоксическом воздействии может быть обусловлено изменением активности работы ферментов антиоксидантной защиты (АОЗ). В условиях гипоксического синдрома происходит дисбаланс физиологического оксидант-антиоксидантного равновесия, о чём свидетельствует достоверная инактивация на 12% первичного фермента АОЗ-СОД в плазме крови животных подвергнутых гипоксии. Однако активность СОД в плазме крови животных 3 группы достоверно возросла на 12% по отношению к контролю, что свидетельствует об ингибировании свободнорадикальных процессов в крови и позитивном состоянии прооксидантно-антиоксидантного равновесия. Однако, данных достоверного увеличения активности фермента в плазме крови крыс после предадаптации аппаратом СКЭНАР и последующего сеанса гипоксии обнаружено не было.



Вторым по значимости ферментом первой линии АОЗ в живых системах является каталаза, проявляющая максимальную активность в отношении перекиси водорода при окислительном стрессе. Анализ динамики изменений активности каталазы свидетельствует о снижении биологической функции фермента на 36% в плазме крови животных, подвергнутых гипоксии. Достоверных результатов влияния СКЭНАР-воздействия на интенсивность каталитической активности у животных 3-ей и 4-ой групп не обнаружен. Тем не менее, животные предадаптированные к действию гипобарической гипоксии путём проведения сеансов СКЭНАР-воздействия в течение 5 дней, показали более мягкое течение гипоксии, что проявлялось в снижении активности фермента каталазы на 33% по сравнению с контрольной группой.

Заключение. Таким образом, особенностью обменных процессов крыс в остром периоде гипоксического синдрома является активизация свободно-радикального окисления и аварийная перестройка метаболизма углеводов, направленная на восстановление энергетического баланса клеток и тканей в условиях резкого дефицита кислорода за счёт альтернативного синтеза АТФ путём субстратного фосфорилирования. В плазме крови формируется комплекс изменений, характерных для гипоксических поражений – депрессия ферментов антиоксидантной защиты, нарушение пуринового обмена, активация гликогенолиза и ПОЛ, с накоплением конечных продуктов. В случае предадаптации животных СКЭНАР-воздействием, в условиях острой гипоксии, в плазме крови крыс отмечено формирование протекторного влияния электроимпульсной терапии на такие биохимические показатели, как уровень ксантина, лактата, мочевой кислоты и МДА, что свидетельствует о снижении тяжести гипоксического состояния, ингибировании свободнорадикального окисления у экспериментальных животных.

Литература

  1. Воляник Т.А. Опыт применения СКЭНАР- терапии в лечении некоторых болевых синдромов в неврологии// СКЭНАР-терапия и СКЭНАР-экспертиза. -Таганрог,1999.-Вып.5.-С.-59-62.

  2. Гринберг Я.З. СКЭНАР-терапия: эффектиность с позиций методов электролечения// СКЭНАР-терапия и СКЭНАР-экспертиза.-Таганрог, 1999,-Вып.2.-С. 18-32.

  3. Гринберг Я.З. Эффективность СКЭНАР-терапии. Физиологические аспекты// СКЭНАР-терапия и СКЭНАР-экспертиза. -Таганрог,-1998.-Вып.4.-С.8-19.

  4. Гужавина Г.П. СКЭНАР-терапия для реабилитации детей в психоневрологическом санатории// СКЭНАР-терапия и СКЭНАР-экспертиза. -Таганрог,1999.-Вып.2.-С.62-64.

  5. Гуляев В.Ю. Щеколдин П.И., Чернышёв В.В. Лечебное применение импульсной низкочастотной терапии/ Уральское медицинское обозревание. – 2001,-№2.-С.-47-54.

  6. Дубинина Е.Е. Некоторые особенности функционирования ферментативной антиоксидантной защиты плазмы крови человека// Биохимия.- 1993.-Т.58;вып.2.-С. 268-273.

  7. Дудченко А.М., Лукьянова Л.Д. Триггерная роль энергетического обмена в каскаде функционально-метаболитических нарушений при гипоксии // Проблемы гипоксии: молекулярные, физиологические и медицинские аспекты. М., 2004. С. 51-84.

  8. Зилов В.Г., Кудаева Л.М., Ревенко А.И. и др. Методика коррекции клинических проявлений соматических, хирургических, неврологических заболеваний электростимулятором «СКЭНАР»: Пособие для врачей. -М.: 2000.

  9. Колб В.Г., Камышников В.С. Справочник по клинической химии. Минск: Беларусь.-1982.-С. 290-292.

  10. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы// Лабор. дело. 1988.-№1.-С.16-19

  11. Крайнова Н.Н., Гуськова Е.Н., Милютина Н.П., Внуков В.В. Свободнорадикальное окисление при ишемической болезни сердца и коррегирующее влияние СКЭНАР-терапии // Известия высших учебн. заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. Ростов н/Д, 2007, № 6, С.64-67.

  12. Кулагин В.К., Болдина И.Г. Основные принципы борьбы с гипоксией при шоке //Пат. физиол. И эксперим. терапия. – 1981. - №4. – с. 10-15.

  13. Лебеденко А.А. СКЭНАР-терапия при атопическом дерматите у детей// СКЭНАР-терапия и СКЭНАР-экспертиза. -Таганрог,-2001.-Вып.7.-С.86-87.

  14. Лукаш А.И., Внуков В.В., Ананян А.А. и др. Металлсодержащие соединения плазмы крови при гипербарической оксигенации (Экспериментальные и клинические аспекты) Ростов-на-Дону. 1996. -108 с.

  15. Маклецова М.Г., Гринберг Я.З., Сталбов А.Э. и др. Влияние СКЭНАР- воздействия на интенсивность перекисного окисления липидов // СКЭНАР-терапия и СКЭНАР-экспертиза. -Таганрог,2001.-Вып.7.-С.-37-38.

  16. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / М.: Фирма «Слово», 2006. – С. 11-140.

  17. Олисов Д.Е. СКЭНАР-терапия в лечении дерматологических больных// СКЭНАР-терапия и СКЭНАР-экспертиза. -Таганрог,-1999.-Вып.5.-С.76-78.

  18. Погорелова Т.Н., Друккер Н.А., Осташевская М.И., Длужевская Т. Способ определения ксантина и гуанина микрометодом Williams J. М. в модификации Т.Н. Погореловой и соавт. Особенности пуринового и нуклеотидного обмена у ювенильных крыс с аллоксановым диабетом// Проблемы эндокринологии.- 1983.- Т. 29. С. 82 - 85.

  19. Сирота Т. В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использования его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопр. мед. химии. – 1999. № 3 . – С. 14 – 15.

  20. Смирнова И.Н. Результаты СКЭНАР- и галотерапии при обструктивных заболеваниях лёгких// СКЭНАР-терапия и СКЭНАР-экспертиза. -Таганрог,-2001,-Вып.7.-С.108-110.

  21. Стальная И.Ф., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии. М.: Медицина. 1977. - С. 63-64.

  22. Тараканов А.В., Гринберг Я.З., Милютина Н.П. Универсальные механизмы действия СКЭНАР при оксидативном стрессе// Рефлексотерапия.-2003.-№4.-С. 41-45.

  23. Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н. Современые представления о патогенезе гипоксий. Классификация гипоксий и пусковые механизмы их развития // Современные наукоемкие технологии.- № 5.- 2006.- С. 23-27

  24. Bidlack W.R. Tappel A.T. Fluorescent products of phospholipids during lipid peroxidation// Lipids, 1973. V. 8. N.4. P. 203 – 209.

  25. Bligh E., Dyer W., Rapid method of lipids extraction and purification// Can. J. Biochem. Physiol. 1959. V. 37.N.8. P. 203-209.

  26. Kaminski W., Jezewska M. Intermediate dehydrogenase – oxidase form of xanthine oxidoreductase in rat liver// Biochem.J.-1979.-№181.-Р.-177-182.

  27. Lewin B.I. Evolutions: free radical protection systems// J. of NIH Res.-1997.-V.9.-P.65-72.

  28. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem.. - 1951. – Vol. 193. - P. 265 – 275.



скачать файл



Смотрите также:
Влияние скэнар-воздействия на интенсивность свободно-радикальных процессов и состояние про- и антиоксидантных систем плазмы крови и эритроцитов крыс при моделировании острой гипоксии
118.24kb.
Влияние жира сардины иваси на повреждение слизистой оболочки желудка крыс этанолом
57.53kb.
Урок №17 «Состав и функции крови» Задачи: Продолжить формирование понятия о внутренней среде и ее компонентах
40.92kb.
Методическая разработка для самостоятельной работы студентов III курса Тема: «Лабораторно-инструментальные методы исследования органов дыхания»
93.15kb.
Рассеяние и Модуляция излучения гиротрона при эц нагреве плазмы стелларатора л-2М
16.91kb.
Урок по биологии на тему: «Функции и состав крови. Тромбоциты. Свёртывание крови. Лейкоциты»
67.17kb.
Магниевая программа благотворно действует на уровень сахара, холестерина в крови, нормализует артериальное давление при его повышении
182.78kb.
Экспериментальное исследование процессов
8.31kb.
Парная регрессия может дать хороший результат при моделировании, если влиянием других факторов, воздействующих на объект исследования, можно пренебречь
198.35kb.
Моделирование бизнес процессов управления: idef
161.51kb.
Донелла Медоуз
2910.81kb.
Влияние пульсирующего электрического поля с частотой 12,5 мгц на эцр нагрев в cera-rx(c)
19.7kb.